LAPORAN PRAKTIKUM
BIOTEKNOLOGI PERTANIAN
“Pembuatan
Media Kultur Jaringan”
OLEH :
KELOMPOK
V (LIMA)
F I T M A N
D1B1 12 057
PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI
JURUSAN AGROTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS HALU OLEO
2014
I.
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kultur jaringan tanaman merupakan
bagian suatu teknik perbanyakan vegetatif nonkonvensional. Perbedaan teknik ini
dibandingkan dengan teknik perbanyakan vegetative konvensional biasanya
terletak dalam situasi dan lokasi yang berbeda. Penerapan teknikkultur jaringan
tanaman mensyaratkan kondisi di dalam ruangan (laboratorium) dan
sifatnyaaseptik (steril dari patogen). Bermuara dalam kondisi yang aseptic,
maka perlu dijelaskan bahwa segala aktifitas yang berkaitan dengan jaringan
harus dalam kondisi aseptik.
Hasil yang lebih baik dapat
dijangkau atau diperoleh, bila ke dalam media tersebut ditambahkan
vitamin-vitamin, asam amino solid dan zat pengatur tubuh. Walaupun sudah
diusahakan untuk menghindarkan penggunaan komponen-komponen yang tidak jelas
(komponennya) seperti jus buah-buahan dan tauge, air kelapa, Yeast Exstracts dan Casein
Hydrolysate, tetapi kadang-kadang kita bisa memperoleh hasil yang lebih
tinggi dengan penambahan tersebut. Sebagai contoh, air kelapa masih sering
digunakan di laboratorium-laboratorium penelitian, sedangkan pisang masih
merupakan komponen tambahan yang sangat popular pada media anggrek.
Peranan
media kultur berhubungan dengan penyediaan unsur hara dan energi serta zat-zat lain yang
dibutuhkan untuk pertumbuhan dan perkembangan bahan eksplan di dalam botol
kultur sehingga sangat berpengaruh terhadap keberhasilan kultur jaringan melihat
peranan penting dari media kultur, maka melaui praktikum ini dilakukan
pembuatan media kultur secara baik dan benar sesuai dengan prosedur yang ada.
B. Tujuan
Tujuan dari praktikum ini yaitu
mahasiswa dapat mengetahui komponen penyusun dengan fungsi masing-masing dalam
media kultur jaringan dan mahasiswa mengetahui serta dapat mempraktekkan cara
membuat larutan stok yang akan dipergunakan dalam membuat media kultur jaringan
sesuai kompotisi medium yang digunakan.
II. TINJAUAN
PUSTAKA
Medium yang digunakan
untuk kultur jaringan tanaman dapat berupa medium padat atau cair. Medium
padat digunakan untuk menghasilkan kalus yang selanjutkan diinduksi membentuk
tanaman yang lengkap, sedangkan medium cair biasanya dugunakan untuk kultur
sel. Medium yang diggunakan mengandung lima komponen utama, yaitu senyawa
anorganik, sumber karbon, vitamin, zat pengatur tumbuh dan suuplemen organik. Kultur jaringan tanaman terdiri dari sejumlah
teknik untuk menumbuhkan organ, jaringan dan sel tumbuhan. Jaringan dapat
dikulturkan pada agar padat atau dalam medium hara cair. Jika ditanam dalam
agar, jaringan akan membentuk kalus, yaitu massa atau sel-sel yang tak tertata.
Kultur agar juga mempergunakan teknik untuk meristem (Suryo,
2004).
Media merupakan suatu bahan yang penting untuk
pertumbuhan kultur. Media untuk pertumbuhan kultur dapat berupa media padat dan
media cair. Media padat biasanya digunakan untuk mengkulturkan kalus kemudian
diinduksi menjadi tanaman lengkap, sedangkan media cair biasanya digunakan
untuk kultur sel. Komponen yang penting dalam suatu media adalah senyawa
anorganik, sumber karbon, vitamin, zat pengatur tumbuh, dan suplemen organik (Yuwono,
2008).
Zat
pengatur tumbuh (ZPT) yang digunakan pada media disimpan dalam gelap pada
refrigerator sebagai larutan stok. Sedikit volume (misalnya 50 mL) larutan stok
mengandung 1 mg mL-1 ZPT dapat disimpan untuk beberapa lama. Kestabilan ZPT bervariasi:
kinetin dan IAA tidak stabil pada kondisi cahaya, sehingga biasanya disimpan
pada botol berwarna gelap. Juga, IAA kehilangan aktivitasnya pada larutan
aqueous sehingga larutan stok IAA sebaiknya tidak disimpan dalam jangka waktu
yang lama (Gunawan, 2001).
Sebelum
membuat media, terlebih dahulu dilakukan pembuatan larutan stok. Larutan stok
dibuat dengan tujuan untuk memudahkan pengambilan bahan-bahan
kimia khususnya yang dibutuhkan dalam jumlah kecil, tak perlu sering menimbang
karena hal ini kurang praktis. Larutan stok disimpan di dalam lemari pendingin
agar tidak mudah rusak dan mencegah terdegradasinya bahan-bahan kimia oleh
mikroba penyebab kontaminasi. Pembuatan larutan stok harus dilakukan dengan
cennat, sebab larutan stok yang terlalu pekat akan mengalami pengendapan di
lemari es dan larutan stok yang terkontaminasi tidak boleh digunakan lagi
(Hendaryono dan Wijayani, 2000).
Medium
yang digunakan untuk kultur jaringan tanaman dapat berupa medium padat
atau cair. Medium padat digunakan untuk menghasilkan kalus yang selanjutkan
diinduksi membentuk tanaman yang lengkap, sedangkan medium cair biasanya
dugunakan untuk kultur sel. Medium yang diggunakan mengandung lima komponen
utama, yaitu senyawa anorganik, sumber karbon, vitamin, zat pengatur tumbuh dan
suuplemen organik (Rahardja, 2002).
Media
merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi
media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak.
Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon.
Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain.
Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya
maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan.
Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca.
Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan
autoklaf (Heddy, 2005).
unsur-unsur kultur
jaringan diberikan
tidak dalam bentuk unsur murni, tetapi berupa senyawa berbentuk garam. Sebelum
dicampurkan kedalam media tumbuh, garam-garam mineral itu haruslah lebih dahulu
dilarutkan dalam konsentrasi tertentu, sehingga dalam media tumbuh nantinya
jumlah tiap gram benar sesuai dengan ketentuan sebagai pelarut dipakai aquades
(Hidayat, 1995).
III. METODE PRAKTIKUM
A. Waktu
dan Tempat
Praktikum ini
dilaksanakan pada hari Jum’at, 07 November 2014
pada pukul 10.00 WITA sampai selesai
dan bertempat di Laboratorium Agroteknologi Unit In Vitro Fakultas Pertanian
Universitas Halu Oleo.
A. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan
dalam praktikum ini yaitu neraca analitik, pipet ukur, gelas ukur, labu takar,
beaker glass, erlenmeyer, PH meter atau
kertas lakmus, autoclave, botol kultur, plastik, karet, kertas label dan aluminium
foil.
Bahan
yang digunakan dalam praktikum ini yaitu
zat pengatur tumbuh (Auksin 2,4-D,
Sitokinin BAP) , medium yang di dinginkan, media murshige dan skoog (MS),
NaOH 0.1 N, NaCL 0.1 N, gula pasir dan agar.
B.
Prosedur Pelaksanaan
Prosedur
pelaksanaan pada praktikum ini yaitu :
1. Membuat
larutan stok auksin 2,4-D,
·
Menimbang auksin 2,4-D
100 mg,
·
Menambahkan
air 100 ml,
·
Memasukkan ke dalam wadah (gelsa
ukur) dilarutkan dengan NaOH
ditetesi sedikit-demisedikit sampai homogen,
2. Membuat larutan
stok sitokinin BAP,
·
Menimbang sitokinin
BAP 100 mg,
·
Memasukkan ke dalam wadah (gelsa ukur)
pelarut NaCl ditetesi sedikit-demisedikit,
·
Menambahkan
air 100 ml sampai homogen,
3. Menimbang media
·
Menggukur
200 ml air (awal) menggunkan
gelas ukur,
·
Menimbang media murshige dan skoog (MS)
1,102 gram,
·
Menimbang agar
1,75 gram,
·
Menimbang gula 7,5 gram dan memasukkan ke
dalam larutan murshige
dan skoog (MS) kemudian
dihomogenkan menggunakan stirer
hot plat,
·
Memasukkan
media murshige
dan skoog (MS) kedalam aquades 200
mg,
·
Memasukkan ZPT sitokinin (BAP)
2 mikro liter
kedalam larutan,
·
Memasukkan ZPT auksin (2,4-D)
75 mikro liter,
·
Menambahkan aquades
sampai 250 ml sampai homogen,
·
Mengukur pH sampai (5,8),
·
Untuk menaikan
pH Menggunkan larutan
NaOH untuk menurunkan
menggunakan larutan NaCl,
·
Memasukkan larutan
agar pada larutan,
·
Kemudian di
homogenkan hingga mendidih dan
jernih,
·
Memasukkan larutan
yang telah siap ke dalam
botol ,
·
Menutup botol
menggunakan plastik dan di
ikat dengan karet,
·
Memasukkan botol yang
berisi media ke dalam
autoclave dengaan suhu 121oC
dengan tekanan 1 Atm selama 15 menit
untuk sterilisasi.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
Pengamtan
Hasil
pengamatan pada praktikum ini dapat dilihat pada tabel berikut.
|
Media
|
Kontam
|
Tidak Kontam
|
|
Botol kultur
1
|
√
|
__
|
|
Botol kultur
2
|
√
|
__
|
|
Botol kultur
3
|
√
|
__
|
|
Botol kultur
4
|
__
|
√
|
|
Botol kultur
5
|
__
|
√
|
|
Botol kultur
6
|
__
|
√
|
|
Botol kultur
7
|
__
|
√
|
|
Botol kultur
8
|
__
|
√
|
|
Botol kultur
9
|
__
|
√
|
|
Botol kultur
10
|
__
|
√
|
B. Pembahasan
Media Murashige & Skoog (media
MS) merupakan media digunakan hampir pada semua macam tanaman terutama
herbaceous. Media ini memiliki konsentrasi garam-garam mineral yang tinggi,
terutama kebutuhan garam anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada
kultur jaringan tembakau dan senyawa N dalam bentuk NO3- dan NH4+.
Keberhasilan dalam penggunaan metode kultur jaringan,
sangat bergantung pada media yang digunakan. Media kultur merupakan salah satu faktor
penentu keberhasilan. Pada media
kultur yang dibuat terdapat tiga media
yang terkontaminasi. Hal ini diketahui dengan cara melihat bagian dari media
kultur yang terkontaminasi (memiliki
jamur). Media tesebut terjadi kontaminasi karena ke tiga media tersebut
kurang steril pada saat melakukan pembuatan media. Sehingga terjadi kontaminasi pada media kultur jaringan. Penyesuaikan
pH yang diinginkan untuk menghasilkan media yang sesuai dengan yang diinginkan
(menghindari perubahan pH yang cukup besar atau yang sangat rendah, pH yang
sesuai adalah 5,6 – 5,8) maka dilakukan pengukuran pH sebelum dilakukan
pensterilan. Jika pH yang dihasilkan rendah maka dititrasi dengan NaOH dan jika pH tinggi maka dititrasi dengan HCl
sampai dperoleh pH yang diinginkan baru diadakan penetapan media disterilkan
dalam autoklaf. Sterilisasi yang dilakukan selama 30 menit dengan suhu 2400C,
mampu mensterilkan media dan alat dari bakteri yang terdapat di lingkungan
alami.
Media yang terkontaminasi sering terjadi
pada kultur jaringan tanaman terdiri atas dua jenis yaitu kontamiasi oleh
bakteri dan kontaminasi oleh jamur. Untuk membedakan kedua jenis kontaminasi
ini, dapat dilihat dari ciri-ciri fisik yang muncul pada eksplan maupun media
kultur. Bila terkena kontaminasi bakteri maka tanaman akan basah atau
menyebabkan adanya lendir, hal ini dikarenakan bakteri langsung menyerang
terhadap jaringan dari tubuh tumbuhan itu sendiri. Sedangkan bila
terkontaminasi oleh jamur, tanaman akan lebih kering dan akan muncul hifa jamur
pada tanaman yang terserang dan biasanya dapat dicirikan dengan adanya garis-garis
(seperti benang) yang berwarna putih. Penyebab terjadinya kontaminasi bisa
diakibatkan karena kesalahan pada saat penanaman, saat sterilisasi media dan
eksplan atau bahkan pada saat pembuatan media.
V.
PENUTUP
A. Kesimpulan
Berdasarkan
hasil dan pembahasan dapat disimpulkan bahwa dalam melakukan pembuatan media
dibutukan kondisi lingkungan
yang steril sehingga
tidakk terjadi kontaminasi pada
media. Penyesuaikan pH yang
diinginkan untuk menghasilkan media yang sesuai dengan yang diinginkan (menghindari
perubahan pH yang cukup besar atau yang sangat rendah, pH yang sesuai adalah
5,6 – 5,8) maka dilakukan pengukuran pH sebelum dilakukan pensterilan. Jika pH
yang dihasilkan rendah maka dititrasi dengan NaOH dan jika pH tinggi maka dititrasi dengan HCl
sampai dperoleh pH yang diinginkan baru diadakan penetapan media disterilkan
dalam autoklaf.
B. Saran
Saran saya
pada praktikum ini
sebaiknya praktikan lebih
banyak bekerja dari asistem praktikum
sehingga kami sebagai
praktikan lebih memahami
mengenai tahap-tahap pembuatan
media kultur jaringan.
DAFTAR PUSTAKA
Gunawan, L.W.
2001. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan.
Laboratorium Kultur Jaringan PAU Bioteknologi. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Hendaryono
D. S. dan Wijayanti. 2000. Pedoman
Kultur Jaringan. Penebar Swadaya . Jakarta.
Heddy. 2005. Hormon
Tumbuhan. CV Rajawali. Jakarta.
Hidayat. 2011. Induksi Kalus
Binahong (Basella rubra L.) Secara In Vitro Pada Media Murashige &
Skoog Dengan Konsentrasi Sukrosa Yang Berbeda.
Rahardja PC. 2002. Kultur
Jaringan. Teknik Perbanyakan Tanaman secara
Modern. Penebar Swadaya. Jakarta.
Suryo. 2004. Genetika. Gadjah Mada University
Press. Jakarta
Yuwono T. 2008. Bioteknologi Pertanian. Universitas
Gajah Mada Press. Yogyakarta.
